ID: J01715
ID: J01715
Epigeneron / Epigeneron
ORNi-PCR® カスタムデザインサービス
標的DNAの増幅を阻害、遺伝子変異の検出をもっと高感度に
カテゴリ
遺伝子工学 > カスタムオリゴヌクレオチド・プライマー・プローブ・遺伝子合成 > DNA合成・RNA合成・人工遺伝子合成
遺伝子工学 > 遺伝子実験 > ゲノム編集（CRISPR-Cas9・TALEN・ZFN）
サービスについて
概要
ご要望の標的に合わせてデザインしたORN（合成RNA：ORN＝オリゴリボヌクレオチド）を用いて標的DNAの増幅を阻害、検出したい遺伝子変異を感度良く捉えることが出来ます。- 遺伝子変異のより高感度な検出に
がん遺伝子や細菌、ウイルスなどで、例えば野生型の増幅阻害によって、変異型をより高感度に確実に検出ができる - ゲノム編集後細胞の確認に
制限酵素では確認が困難な点変異なども感度良く、シーケンスほどの手間もコストもかからずに確認ができる - 測定ノイズの削減等のサンプル濃縮に
食性解析におけるホスト由来DNAや細菌叢解析における優占種の排除などに応用ができる
【原理】（fig.1）
特長
ORNi-PCR® 遺伝子変異の検出をもっと高感度に、より確実にタ－ゲットにあわせてデザインしたORNによるPCR反応中の伸長阻害を利用し、遺伝子変異の高感度検出を実現します。
ORN＝オリゴリボヌクレオチド（合成RNA）は、
・増幅阻害をかけたいタ－ゲットに対し、容易にデザインができます。
・末端への修飾などは必要ありません
・リアルタイムPCR、各種等温増幅法などへの応用が可能です。
参考データ
より高感度な遺伝子変異検出 検出感度データ（1塩基変異の検出例）- 2-step リアルタイムPCRによるEGFR L858R変異の検出感度の検証（fig.2）
・野生型（293T)と変異型（NCI-H1975）からDNAを抽出し、濃度調整したサンプルを使用
・1st Stepで野生型に相補的なORNを添加しPCR反応
・2nd Stepでその反応産物に変異型検出用プロ－ブを加えてリアルタイムPCRを実施
・ORN添加（左図）は0.015%の濃度もシグナルが立ち上がっている
・ORN未添加（右図）はシグナルが立ち上がらなかった
1塩基変異検出へのORN技術の利用例（COVID-19）
- SARS-CoV-2ウイルス D614型／G614型 サブタイプ判別例（fig.3）
・D614型及びG614型のそれぞれ相補的なORNをデザインして添加
・PCR反応後の産物を電気泳動で確認、D614型ORN添加によるD614型阻害（右図写真A）、G614型ORN添加によるG614型阻害（右図写真B）
ゲノム編集後細胞確認への応用（fig.4）
・ゲノム編集後細胞の確認手法比較（対一般的な制限酵素法）、編集されていない野生型遺伝子配列に相補的なORNを使用し、変異が起こった細胞を選択的に検出できる
・一般的な制限酵素を使う方法に比べて、ORNi-PCRは手順、時間等で大きく削減できる可能性がある
・サンガ－シ－ケンスなどによる最終確認もORNi-PCRの産物を利用できる
測定ノイズ等の削減によるサンプル濃縮（fig.5）
・NGSライブラリー中の優占種由来のリード数抑制により、希少種由来リード数が増え、
希少種のNGS解析の高精度化、もしくはリード数抑制により解析コスト半減が可能。
・細菌叢解析に広く応用可能（土壌中、水中）
・種間の相対的な量（組成比率）は影響を受けない。ORNの標的種以外は、種間の量的解析が可能。
・rRNA除去や変異配列の濃縮に応用可能（標的配列の数、種類により検討可能）
参考文献
- Tanigawa N, Fujita T, and Fujii H: Oligoribonucleotide (ORN) interference-PCR (ORNi-PCR): a simple method for suppressing PCR amplification of specific DNA sequences using ORNs. PLoS One (2014) 9, e113345.
- Fujita T, Yuno M, Kitaura F, Fujii H: Detection of genome-edited cells by oligoribonucleotide interference-PCR. DNA Res. (2018) 25, 395-407.
- Fujita T, Yuno M, Kitaura F, Fujii H: A refined two-step oligoribonucleotide interference-PCR method for precise discrimination of nucleotide differences. Sci. Rep. (2018) 8, 17195.
- Fujita T, Motooka D, Fujii H: Target enrichment from a DNA mixture by oligoribonucleotide interference-PCR (ORNi-PCR). Biology Methods and Protocols (BIOMAP) (2019) 4, bpz009.
- Baba K, Fujita T, Tasaka S, Fujii H: Simultaneous detection of the T790M and L858R mutations in the EGFR gene by oligoribonucleotide interference-PCR. Int. J. Mol. Sci. (2019) 20, 4020.
- Shimizu T, Fujita T, Fukushi S, Horino Y, Fujii H: Discrimination of CpG methylation status and nucleotide differences in tissue specimen DNA by oligoribonucleotide interference-PCR. Int. J. Mol. Sci. (2020) 21, 5119.
ORNi-PCRのデザインに必要な情報（詳細はお問合せ下さい）
- 検体に関する情報
- 検体の種類とDNA（genomic DNA, plasmid DNA, cDNA, etc.） - ターゲット配列に関する情報
- 阻害ターゲットの配列
- 検出ターゲット の配列
- 使用するPrimerの情報
- アンプリコンサイズ
＊ 使用したいPrimerでのプロトコ－ルデザインを致しますが、例えばORNとの距離やアンプリコンサイズなどによってはPrimerも含めたデザインを提案いたします。 - 希望するタ－ゲット検出法
- ORNi-PCR後に電気泳動での確認（通常）
- ORNi-PCR＋qPCR、1 STEP / 2 STEP など
納品物
- カスタムデザインORN
- ご要望のターゲットに合わせてデザインしたカスタムオーダーORN
- 納品物：ORN（＊1）＋ORNi-PCR机上案プロトコ－ル＋ORN説明書 - カスタムデザインORNプロトコール検証
- 机上案プロトコ－ルを用いたデ－タ確認
- 納品物：検討報告書＋ORN（＊1）
ご注文に関して
下記のORN見積依頼書にご記入頂き、お送りください。
専用注文書類
参考価格・納期
| サービス項目 | 価格（税抜） | 納期 |
|---|---|---|
| ORNi-PCR® カスタムデザインサ－ビス | お問い合わせ | 約2週間 |
関連サイト
- ※価格及び、サービスの仕様・内容などにつきまして、予告なしに変更されることがあります。
- ※表示している参考価格は消費税等は含まれておりません。
- ※受託サービスは、すべて研究目的として作業を行います。その他の目的（医療品・食品の製造・品質管理や医療診断など）には使用しないで下さい。
- ※納期は参考納期です。諸事情により、前後する場合がございます。納期の詳細については個別にお問い合わせください。
- ※会社名・サービス名などは、各社の商標・登録商標です。
- ※納品物によっては、その構成物（例えば、ベクター、蛍光色素など）の使用に制限がある場合があります。
- ※ヒト臨床サンプルの場合はインフォームドコンセントを得ていることをご確認ください。
ヒト由来のサンプルの場合、ご所属の組織の倫理委員会などで承認が得られたものが受領されます。 - ※人間への感染性が疑われるサンプルに関しては、お受けできない可能性がございます。
- ※サンプルの保管および返却を行っていない場合があります。お客様より提供いただいたサンプルおよび解析データ等は、業務終了後、廃棄される場合がございます。