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和研薬株式会社

ID: J01715
ID: J01715
Epigeneron / Epigeneron(エピジェネロン)

ORNi-PCR® カスタムデザインサービス

標的DNAの増幅を阻害、遺伝子変異の検出をもっと高感度に


カテゴリ
遺伝子工学 > カスタムオリゴヌクレオチド・プライマー・プローブ・遺伝子合成 > DNA合成・RNA合成・人工遺伝子合成
遺伝子工学 > 遺伝子実験 > ゲノム編集(CRISPR-Cas9・TALEN・ZFN)

サービスについて

概要

ご要望の標的に合わせてデザインしたORN(合成RNA:ORN=オリゴリボヌクレオチド)を用いて標的DNAの増幅を阻害、検出したい遺伝子変異を感度良く捉えることが出来ます。

  • 遺伝子変異のより高感度な検出に
    がん遺伝子や細菌、ウイルスなどで、例えば野生型の増幅阻害によって、変異型をより高感度に確実に検出ができる
  • ゲノム編集後細胞の確認に
    制限酵素では確認が困難な点変異なども感度良く、シーケンスほどの手間もコストもかからずに確認ができる
  • 測定ノイズの削減等のサンプル濃縮に
    食性解析におけるホスト由来DNAや細菌叢解析における優占種の排除などに応用ができる

【原理】(fig.1

特長

ORNi-PCR® 遺伝子変異の検出をもっと高感度に、より確実

タ-ゲットにあわせてデザインしたORNによるPCR反応中の伸長阻害を利用し、遺伝子変異の高感度検出を実現します。

ORN=オリゴリボヌクレオチド(合成RNA)は、
 ・増幅阻害をかけたいタ-ゲットに対し、容易にデザインができます。
 ・末端への修飾などは必要ありません
 ・リアルタイムPCR、各種等温増幅法などへの応用が可能です。

参考データ

より高感度な遺伝子変異検出 検出感度データ(1塩基変異の検出例)
- 2-step リアルタイムPCRによるEGFR L858R変異の検出感度の検証(fig.2
・野生型(293T)と変異型(NCI-H1975)からDNAを抽出し、濃度調整したサンプルを使用
・1st Stepで野生型に相補的なORNを添加しPCR反応
・2nd Stepでその反応産物に変異型検出用プロ-ブを加えてリアルタイムPCRを実施
・ORN添加(左図)は0.015%の濃度もシグナルが立ち上がっている
・ORN未添加(右図)はシグナルが立ち上がらなかった
1塩基変異検出へのORN技術の利用例(COVID-19)
- SARS-CoV-2ウイルス D614型/G614型 サブタイプ判別例(fig.3
・D614型及びG614型のそれぞれ相補的なORNをデザインして添加
・PCR反応後の産物を電気泳動で確認、D614型ORN添加によるD614型阻害(右図写真A)、G614型ORN添加によるG614型阻害(右図写真B)

ゲノム編集後細胞確認への応用fig.4
・ゲノム編集後細胞の確認手法比較(対一般的な制限酵素法)、編集されていない野生型遺伝子配列に相補的なORNを使用し、変異が起こった細胞を選択的に検出できる
・一般的な制限酵素を使う方法に比べて、ORNi-PCRは手順、時間等で大きく削減できる可能性がある
・サンガ-シ-ケンスなどによる最終確認もORNi-PCRの産物を利用できる

測定ノイズ等の削減によるサンプル濃縮fig.5
・NGSライブラリー中の優占種由来のリード数抑制により、希少種由来リード数が増え、
 希少種のNGS解析の高精度化、もしくはリード数抑制により解析コスト半減が可能。
・細菌叢解析に広く応用可能(土壌中、水中)
・種間の相対的な量(組成比率)は影響を受けない。ORNの標的種以外は、種間の量的解析が可能。
・rRNA除去や変異配列の濃縮に応用可能(標的配列の数、種類により検討可能)

参考文献

  1. Tanigawa N, Fujita T, and Fujii H: Oligoribonucleotide (ORN) interference-PCR (ORNi-PCR): a simple method for suppressing PCR amplification of specific DNA sequences using ORNs. PLoS One (2014) 9, e113345.
  2. Fujita T, Yuno M, Kitaura F, Fujii H: Detection of genome-edited cells by oligoribonucleotide interference-PCR. DNA Res. (2018) 25, 395-407.
  3. Fujita T, Yuno M, Kitaura F, Fujii H: A refined two-step oligoribonucleotide interference-PCR method for precise discrimination of nucleotide differences. Sci. Rep. (2018) 8, 17195.
  4. Fujita T, Motooka D, Fujii H: Target enrichment from a DNA mixture by oligoribonucleotide interference-PCR (ORNi-PCR). Biology Methods and Protocols (BIOMAP) (2019) 4, bpz009.
  5. Baba K, Fujita T, Tasaka S, Fujii H: Simultaneous detection of the T790M and L858R mutations in the EGFR gene by oligoribonucleotide interference-PCR. Int. J. Mol. Sci. (2019) 20, 4020.
  6. Shimizu T, Fujita T, Fukushi S, Horino Y, Fujii H: Discrimination of CpG methylation status and nucleotide differences in tissue specimen DNA by oligoribonucleotide interference-PCR. Int. J. Mol. Sci. (2020) 21, 5119.

ORNi-PCRのデザインに必要な情報(詳細はお問合せ下さい)

  • 検体に関する情報
    - 検体の種類とDNA(genomic DNA, plasmid DNA, cDNA, etc.)
  • ターゲット配列に関する情報
    - 阻害ターゲットの配列
    - 検出ターゲット の配列
    - 使用するPrimerの情報
    - アンプリコンサイズ
    * 使用したいPrimerでのプロトコ-ルデザインを致しますが、例えばORNとの距離やアンプリコンサイズなどによってはPrimerも含めたデザインを提案いたします。
  • 希望するタ-ゲット検出法
    - ORNi-PCR後に電気泳動での確認(通常)
    - ORNi-PCR+qPCR、1 STEP / 2 STEP など

納品物

  • カスタムデザインORN
    - ご要望のターゲットに合わせてデザインしたカスタムオーダーORN
    - 納品物:ORN(*1)+ORNi-PCR机上案プロトコ-ル+ORN説明書
  • カスタムデザインORNプロトコール検証
    - 机上案プロトコ-ルを用いたデ-タ確認
    - 納品物:検討報告書+ORN(*1)
*1 プロトコ-ル検証の場合は、検証デ-タ(検討報告書)と同時にORN納品(納期はお問合せ下さい)

ご注文に関して

下記のORN見積依頼書にご記入頂き、お送りください。

専用注文書類

参考価格・納期

サービス項目 価格(税抜) 納期
ORNi-PCR® カスタムデザインサ-ビス お問い合わせ 約2週間

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