概要
安評センターでは、ゲノム編集技術（CRISPR/Cas9）による遺伝子改変マウスの作製受託サービスを提供しています。新しいゲノム編集技術（CRISPR/Cas9）の出現は、遺伝子改変マウス作製にブレークスルーをもたらしたと言われています。効率が良い・作製が早い・費用が安いことが特長としてよく挙げられています。
特長
- Broad研究所よりライセンス許諾を受けて実施しております。
- Cas9ベクターあるいはCas9タンパク質を用いたインジェクションを実施しております。(fig.1)
- 標的遺伝子に対するガイドRNA設計からin vitro活性評価も実施いたします。
- ガイドRNAの設計から生体マウス作製まで、トータルサービスのご提供が可能です。また、一部工程のみの実施も可能です。
- ドナーを用いたノックインも承ります。
- 導入効率が高く、産子の50％以上に変異導入されることが期待できます。
- 各種目的に応じたストラテジー相談から実施させていただきます。標的遺伝子によっては、本手法が実施できない場合もあります。その場合は別の作製方法を提案させていただきます。
これまでの作製方法との比較（fig.2）
作業概要
- guideRNA設計と活性確認
標的遺伝子に対してgRNA を設計し、その標的配列を認識・切断できるかどうか in vitroで切断活性評価を行います。ご要望に応じて、Cas9発現ベクターの構築も実施いたします。（fig.3）
- 受精卵へのインジェクション
既存のトランスジェニックマウス作製と同様の方法を用いて、Cas9タンパク質とRNAの複合体を受精卵にインジェクションします。同時にドナーをインジェクションすることで、相同組換えによるノックインを期待します。（fig.4）
＊ 実施内容については、ご要望を踏まえご提案させていただきます。
- ファウンダーマウスの同定
変異が導入されている産子（ファウンダーマウス）をスクリーニングします。ダイレクトシーケンスによって変異体の検出を実施します。
これまでの結果から、産子の半数以上（2015年3月実績 約20系統の平均63％）に変異が導入されることが期待されます。
- F1ヘテロマウスの取得
ファウンダーマウスのうち、目的通りの変異が導入されている個体を選択し、次世代(F1)マウスを作製します。
ファウンダーマウスはモザイク（変異が導入された細胞とされていない細胞が混在している）なので、次世代マウスに生殖系列伝播した個体を作出し、かつ変異を特定する必要があります。この工程で作出される次世代マウスは、ヘテロ(+/-)マウスです。 （fig.5）
その他実施例 （受精卵へのインジェクション）（fig.6）
Cas9ベクターと同時にssOligoDNAを受精卵にインジェクションして、ポイントミューテーション（点変異）をノックインしました。
これまでに、1塩基欠失、1塩基置換、3塩基欠失などの変異マウスを得ることに成功しています。
その他実施例 （ES細胞への導入）（fig.7）
ES細胞を用いて、相同組換え法との組み合わせにより、2箇所のloxP配列を挿入したコンディショナル・ポテンシャルのES細胞クローンを取得しております。
その他実施例（高効率 CRISPR/Cas9 ノックイン法）
Cas9タンパク質とRNAおよびドナーを一緒に受精卵に導入することで、ゲノム中の特定の場所へノックインすることができます。
これまでは難しかった点突然変異の導入や大きなサイズの組換えを、受精卵で効率よく行うことが可能で、CRISPR/Cas9 によるマウス作製受託の適用範囲がさらに拡大するものと考えられます。
CRISPR/Cas9のライセンス状況
トランスジェニック社は、2015年4月21日に米国Broad研究所からCRISPR/Cas9に関する特許群（US8,697,359B1他）の日本国内における非独占的実施権を取得しております（参考：
ゲノム編集技術（CRISPR/Cas9）に関する非独占ライセンス契約締結のお知らせ）。
トランスジェニック社を通して株式会社安評センターで受託作製した遺伝子組換えマウスは、お客様の機関内における研究目的での使用が認められています。
また、国立大学法人東京医科歯科大学より高効率 CRISPR/Cas9 ノックイン法に関する特許の日本国内での非独占的使用権許諾を受けております。
＊ 作製費用にはBroad 研究所および東京医科歯科大学へのライセンス料を含みます。
| 工程 |
作業内容 |
価格（税抜） |
納期 |
| 1. guide RNA設計と活性確認 |
guideRNAを構築します(in vitroでの切断活性評価も含む)。 |
お問い合わせ |
約1～2ヶ月 |
| 2. インジェクション（C57BL/6N) |
受精卵（C57BL/6系統）200個を用いて、インジェクションを実施いたします。 |
お問い合わせ |
約3ヶ月 |
| 3. ファウンダーマウスの導入変異解析 |
ダイレクトシークエンスによる導入変異の解析をいたします。 |
お問い合わせ |
約1ヶ月 |
| 合計 |
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お問い合わせ |
約5～6ヶ月 |
＊ 価格にはライセンス料を含んでいます。
＊ ファウンダーマウス（F0）を作製します。
＊ 解析の結果、ファウンダーマウスが得られなかった場合、3.の費用はご請求致しません。
＊ マウスの輸送費・微生物検査費は、別途申し受けます。
オプション
| 工程 |
作業内容 |
価格（税抜） |
納期 |
自然交配による
次世代マウスの作製 |
ファウンダーマウスと野生型マウスとの自然交配により、次世代マウスを作製します。
産子全頭について、ダイレクトシーケンスによる導入変異の解析をいたします。
＊ SPF施設の飼育ラック1棚を占有させ、1世代（3ヶ月間）の飼育・繁殖を行います。産子については、8週齢までの飼育とダイレクトシーケンスによる変異配列の解析を実施します。
＊ 1棚は10ケージを収納する規模です。交配・繁殖の進行に伴い、適宜、ケージ数を調整します。
＊ 妊娠出産に至らず産子が得られないときは、交配費用のみでの精算とさせていただきます。
|
お問い合わせ |
約3ヶ月 |
＊ 上記の他、様々なストラテジー（ノックイン、floxマウス作製など）についても、ご相談を承ります。
